Блоттинг (от англ. "blot " - пятно) - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация.

Методы разделения молекул для блоттинга:

• электрофорез в полиакриламидном геле:
o в денатурирующих условиях с добавлением мочевины - разделение коротких одноцепочечных НК;
o в денатурирующих условиях с добавлением натрия додецилсульфата (электрофорез по Лэммли) - разделение белков по молекулярной массе;
o в нативных условиях - разделение белков по трехмерной структуре;
• изоэлектрофокусирование - для разделения белков по изоэлектрической точке (pI);
• двумерный (2D) электрофорез - для разделения белков в двух направлениях - по изоэлектрической точке и по молекулярной массе;
• электрофорез в агарозном геле - разделение НК:
o по длине линейных фрагментов;
o по "суперспирализации" кольцевых молекул;
• тонкослойная хроматография - разделение липидов из липидных комплексов.

Методы переноса:

• диффузия молекул - медленный перенос, часто применяется для липидов;
• капиллярный блоттинг - мембрана прижимается к гелю, поверх нее кладется стопка фильтровальной бумаги, буфер для переноса увлажняет гель и поднимается под действием капиллярных сил, смачивая фильтровальную бумагу и перенося макромолекулы из геля на мембрану; капиллярный блоттинг может осуществляться:
o в камерах с увлажнением геля буфером - "полусухим" переносом;
o в камерах с погружением геля в буфер;

• вакуумный блоттинг - аналогичен капиллярному блоттингу, но перенос ускоряется за счет использования вакуума вместо капиллярных сил, создаваемых при смачивании фильтровальной бумаги;
• электроблоттинг - перенос заряженных макромолекул на мембрану происходит под действием электрического тока;
• "пришивание" НК к мембране под действием УФ-облучения или нагрева - для окончательного закрепления на нейлоновых мембранах;
• дот-блоттинг (слот-блоттинг) - нанесение образца производится в виде точки или черточки непосредственно на мембрану без предшествующего разделения молекул в геле или на ТСХ-пластине.

Типы мембран:

• PVDF-мембраны (поливинилиденфторидные);
• NC-мембраны (нитроцеллюлозные);
• нейлоновые мембраны (применяются для НК).

Способы мечения и детекции макромолекул на мембране:

• окрашивание - связывание красителя (ионов серебра, Кумасси, Понсо, этидия бромистого) непосредственно с детектируемыми макромолекулами;
• иммунохимическое мечение - мечение макромолекул происходит за счет специфически связывающихся с ними меченых антител, детекция осуществляется:
o иммуноокрашиванием - антитела метятся красителями, регистрируется поглощение света определенной длины волны;
o иммуноферментно - антитела метятся ферментом, регистрируется количество окрашенного продукта, наработанного в ходе ферментативной реакции (ИФА);
o хемилюминесцентно - антителя метятся репортерным ферментом, который в присутствии субстрата излучает свечение, регистрируется испускание света
определенной длины волны;
o флуоресцентно - антитела метятся флуоресцентной меткой, которая возбуждается светом определенной длины волны, регистрируется испускание света в
более длинноволновой области;
• радиационное мечение - в макромолекулы вводятся радиационные метки (радиоизотопы), детекция осуществляется с помощью:
o авторадиографии (наложением на мембрану фотопленки);
o радиоимаджинга (количественного определения радиационной эмиссии и построения картины взаимного расположения меток);
• гибридизация - связывание нуклеиновых кислот мечеными олигонуклеотидами с комплементарной структурой, детекция, как правило, осуществляется регистрацией испускания радиационного излучения или флуоресценции метки;
• масс-спектрометрия - используется для прямого структурного анализа липидов.

Принятые названия разновидностей блоттинга:

• Саузерн-блоттинг (блоттинг по Саузерну) - по фамилии Эдвина Саузерна, предложившего метод - определение последовательности ДНК в образце и определение числа копий генов в геномной ДНК. Переносу на мембрану предшествует расщепление образца эндонуклеазами рестрикции на фрагменты и их фракционирование электрофорезом в агарозном геле. Анализ на мембране осуществляется гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами известной последовательности;
• нозерн-блоттинг - определение последовательности РНК в образце и изучение генной экспрессии (определение мРНК). Аналогичен блоттингу по Саузерну, но исследуются выделенные из образца молекулы РНК, без расщепления эндонуклеазами. Разделение молекул проводят в агарозном геле с добавлением формальдегида (для денатурации РНК) или в полиакриламидном геле с добавлением мочевины (применяется для анализа микроРНК). Иммобилизация молекул РНК на мембране происходит за счет нагревания под вакуумом или "пришиванием" с помощью УФ-облучения;
• вестерн-блоттинг - белковый иммуноблоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфических белков в образце. Переносу на мембрану предшествует разделение белков в полиакриламидном геле. Анализ белков на мембране осуществляется иммунохимически;
• фар-вестерн блоттинг - белковый блоттинг, используется для определения белок-белковых взаимодействий, аналогичен вестерн-блоттингу, но вместо антител используются другие белки, специфически связывающиеся с исследуемым белком;
• соузвестерн-блоттинг - определение белков, связывающихся с ДНК, и сайтов в молекулах ДНК, с которыми связываются белки - аналогичен вестерн-блоттингу, но после денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле белки отмываются от натрия додецилсульфата в присутствии мочевины и за счет диффузии переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве пробы используют меченые фрагменты ДНК разной длины, полученные расщеплением более крупного исследуемого фрагмента геномной ДНК. Связавшиеся молекулы ДНК затем вымываются из каждого комплекса белок-ДНК и анализируются электрофорезом в полиакриламидном геле;
• истерн-блоттинг - определение посттрансляционных модификаций белков (связанных с ними липидов, гликополисахаридов, фосфатных остатков) - аналогичен вестерн-блоттингу, но используются антитела не к белкам, а к липидам, гликополисахаридам и т.д. Также в качестве проб используются помимо антител другие белковые молекулы связывающиеся с исследуемыми (например, лектин);
• фар-истерн-блоттинг - анализ липидов, разделенных высокоэффективной тонкослойной хроматографией. Перенос на мембрану, как правило, осуществляется за счет диффузии. Регистрация производится прямым масс-спектрометрическим структурным анализом.

Вестерн блоттинг

Профессор кафедры биохимии
и молекулярной биологии,
Д.м.н. Спирина Людмила
Викторовна
Вестерн блоттинг

Определение. Вестерн-блоттинг
(вестерн-блот,

аналитический
метод,
используемый для
определения
специфичных
белков в образце.

Определение. Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting)

Определение. Вестерн-блоттинг
(вестерн-блот,
белковый иммуноблот, Western bloting)
Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории
Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)
Название вестерн-блот было дано технике У.
Нейлом Бурнеттом и является игрой слов от
названия Саузерн Блоттинг (Southern blotting). методики определения ДНК, разработанной
ранее Эдвином Саузерном

Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)

Western Blotting –
метод определения
белков
Саузерн блоттингметодики
определения ДНК,
разработанной
ранее Эдвином
Саузерном Southern
blotting).
Аналогичный метод
определения РНК
называется Нозерн
Блоттинг (Nothern
blotting).
Детекция
посттрансляционных
модификаций белков
называется Истерн
Блоттингом (Eastern
blotting).

протокол. ПРОТОКОЛ

ПРОТОКОЛ
1. Разделение белков
методом SDS-PAGE гельэлектрофореза/
С помощью гель-электрофореза
белки разделяются в
полиакриламидном геле.
2. Перенос белков на
мембрану
3. Блокирование и Детекция
Затем их детектируют с
использованием антител:
сначала белки связываются с
первичными (моно- или
поликлональными) антителами,
которые в свою очередь
связываются
со вторичными антителами,
конъюгированными с ферментами
(пероксидазой хрена или
щелочной фосфатазой).

протокол. Вестерн-блоттингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг.

протокол.
Вестерн-блоттингом можно обнаруживать
антиген в количествах менее 1нг.
4. Визуализация.
Высокая степень
разрешения достигается за
счет электрофоретического
разделения белков и
специфичности
моноклональных антител.
Визуализация
исследуемого белка
достигается путем
проведения
соответствующей
биохимической реакции с
образованием продукта,
который определяется
колориметрическим,хемилюминесцентным,
флюоресцентным методами
детекции.

5. Анализ.

Количество белка оценивается с
помощью денситометрии.

Southern Blotting Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть геном

Геномную ДНК (обычно
выделенную из
лейкоцитов или клеток
плода) расщепляют на
короткие фрагменты,
разделяют их в агарозном
геле, переносят на
мембрану, после чего
идентифицируют
специфические участки с
помощью гибридизации с
олигонуклеотидными
зондами.

Nothern Blotting

Аналог Southern Blotting.
Этот метод позволяет выявить специфическую
мРНК и оценить ее размер.

Eastern Blotting (является продолжением метода Вестерн блоттинг)

Определение метода Вестерн Блоттинг

Метод основан на
комбинации гельэлектрофореза и
иммунохимической
реакции «антигенантитело».

«Твердая фаза» для иммуноблота

пористые материалы типа
нитроцеллюлозы (PVDF) в виде
наполнителей в объеме или в виде
плоских листов или полосок стрипов
(англ. strip); стрипы используют в
методиках типа иммуноблота и
иммунохроматографии;
в пористых материалах существенно
больше площадь, на которой
сорбирован один из участников
взаимодействия; другие реагенты
диффундируют по порам.

Типы твердой фазы для Вестерн блоттинга

Подготовка образца

Образец может быть взят из цельной
ткани или из клеточной культуры. В Цельная ткань
Клеточная культура
большинстве случаев, твёрдые ткани
сначала измельчаются механически
с использованием блендера (для
образцов большого объёма), с
Механическое измельчение
использованием гомогенизатора
(меньшие объемы), или
обработки ультразвуком.
Различные детергенты детергенты,Измельчение гомогенизатором
соли и буферы могут быть
применены для
улучшения лизиса клеток и
растворения белков.
Обработка ультразвуком
Ингибиторы протеаз и фосфатаз част
о добавляются для предотвращения
расщепления образцов их
Измельчение в жидком азоте
собственными ферментами.
Подготовка тканей часто
выполняется при низких
температурах, чтобы
Ингибиторы протеаз, фосфатаз
избежать денатурации белка.
Условия, улучшающие
пробоподготовку
Детергенты, соли, буферы
производит гомогенизацию образцов за счет их встряхивания
в микропробирках или чашах вместе с твердыми шариками
Низкие температуры

Гель-электрофорез. Наиболее распространенный способ разделения белков - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS по Лэмми

Гель-электрофорез. Наиболее
распространенный способ
разделения белков -
электрофорез в
полиакриламидном геле в
присутствии SDS по Лэмми

Гель-электрофорез

Гель-электрофорез
SDS вызывает
денатурацию белков
и поддерживает их в
денатурированном
состоянии, для
разрушения
вторичных и
третичных структур
белков используют
восстановители
дисульфидных
связей

Гель -электрофорез

Подлежащие
анализу белки в
присутствии
додецилсульфата
натрия приобретают
одинаковый
отрицательный
заряд, что делает
возможным их
разделение в
зависимости только
от молекулярной

Принцип электрофореза

Предварительно
денатурированные белки
вносят в карманы «треков»
(дорожек) акриламидного геля
с низкой концентрацией
(концентрирующий гель), что
позволяет их сконцентрировать
перед переходом в
разделяющий гель (с более
высокой концентрацией), где
происходит разделение белков
в зависимости от молекулярной
массы.
Белки мигрируют в
электрическом поле через
акриламидный гель к аноду,
при этом белки меньшего
размера двигаются быстрее.

Принцип электрофореза

Отличия в скорости
продвижения -
электрофоретической
подвижности приводит к
разделению белков на полосы.
Как правило, одну из
«дорожек» оставляют для
маркеров молекулярной массы
(смеси белков с известными
массами).

Окрашивание гелей

окрашивание белков в
гелях красителем
Кумасси
окрашивание белков в
гелях серебром
Для визуализации результатов электрофореза чаще
всего используют окрашивание белков в гелях
красителем Кумасси или серебром

В большинстве случаев результаты
электрофоретического разделения достаточно
получить путем визуальной оценки геля.
Однако, с целью получения достоверных данных и
надлежащего документирования результатов гель
сканируют на просвет при помощи высокочувствительного
денситометра, что позволяет надежно определять не
только положение белков в геле, но и оптическую
плотность белкового пятна.
Окрашивание
мембраны более
надежно

Анализ электрофоретического разделения белков, Блоттинг

С помощью специального программного приложения
можно определить такие параметры как
электрофоретическая подвижность белка, его
чистота, количество белка в пятне и др.
Чаще используют хемилюминесцентную систему
детекции белков – использование рентгеновских пленок
(Блоттинг)
Используют
программное
приложение ImageJ

Применение системы визуализации для WB (см. ниже)

Анализ электрофоретического разделения белков

Определение молекулярной массы исследуемого белка
предполагает необходимость калибровки геля по
молекулярным массам. Калибруют гель относительно
молекулярных масс белков-маркеров, которые
разделяют параллельно с исследуемым образцом.

Выбор % разрешающего геля.

концентрация
акриламида определяет
разрешающую
способность геля - чем
выше концентрация
акриламида, тем лучше
разделение
низкомолекулярных
белков. Низкая
концентрация
акриламида улучшает
разрешающую
способность гельэлектрофореза для
высокомолекулярных
Размер белка, kDa
%AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%

Перенос на мембрану Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изг

Перенос на мембрану
Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской
геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или PVDF.
Мембрана накладывается поверх геля,
а поверх неё кладут стопку
фильтровальной бумаги.
Метод переноса белков
называется электроблоттингом и
использует электрический ток, который
переносит белки из геля на мембрану.
Белки перемещаются из геля на
мембрану с сохранением своего
расположения. В результате этого
«промакивания» (blotting) процесса
белки удерживаются на тонком
поверхностном слое мембраны для
детекции.
Оба варианта мембран используют изза их свойства неспецифично связывать
белки.
Связывание белков основано как
на гидрофобных взаимодействиях, так
и на электростатических
взаимодействиях между мембраной и
белком.
Нитроцеллюлозная мембрана дешевле
PVDF, но гораздо более хрупкая и хуже
выдерживает повторное нанесение
меток.

Виды электроблоттинга

Сухой
Влажный
Полусухой
(semidry)

Окрашивание белков на фильтре

Способ
окраски
Ponceau S
Чувствительность,
количество
белка
1-2µg
Нитроцеллюлоза
+
Нейлон
-
PVDF
+
Amido
Black
1.5µg
+
-
+
Comassie
blue
1.5µg
+
-
+
India ink
100ng
+
-
+
Biotinavidin
30ng
+
+
+
Colloidal
gold
3ng
+
-
+
Окрашивание
обратимое
постоянное, низкий фон
постоянное, высокий фон
постоянное
постоянное, бледнеет со
временем
постоянное

Подтверждение переноса белков на фильтр (окраска Ponceus)

Блокирование

Как только выбрана
мембрана, выбраны антитела
и целевой белок, должны
быть приняты меры по
исключению взаимодействия
между мембраной и
антителом, используемым для
детекции целевого белка (ибо
антитело само по себе белок).
Блокирование
неспецифичных связываний
достигается помещением
мембраны в разбавленный
раствор белка - обычно это
бычий сывороточный
альбумин или нежирное
сухое молоко или желатин
с небольшим процентом
детергента типа Tween-20.
Блокирование – один из
важных этапов
проведения
эффективного Вестерн
блоттинга

Механизм блокирования

Белок
из разбавленного
раствора прикрепляется к
мембране во всех местах,
где не прикрепился целевой
белок. Поэтому, при
добавлении антител, им
(антителам) нет свободного
места на мембране, куда бы
они могли прикрепиться,
кроме сайтов связывания на
специфичных целевых
белках. Этот фоновый
«шум» в окончательном
продукте вестерн блота
приводит к чистым
результатам и
исключению ложно-

Детекция. Непрямой и прямой WB

преимущества
Вторичное антитело усиливает сигнал (несколько вторичных
антител могут связываться с одним первичным)
Имеется широкий выбор вторичных антител
Одно вторичное антитела может быть использовано для
детекции различных специфичных антител
связывание с ферментативной меткой вторичного антитела не
влияет на иммунореактивность первичного антитела
Замена вторичного антитела может способствовать изменению
метода детекции
недостатки
Вторичные антитела способствуют образованию сайтов
неспецифичного связывания
Дополнительные этапы работы
преимущества
необходимость использовать только
первичные антитела, что ускоряет процесс
возможность использовать первичные
антитела с разными метками
Недостатки
связывание с ферментативной меткой
может снижать иммунореактивность
первичного антитела
высокая стоимость первичных антител
проблема выбора антитела и низкий
сигнал

Детекция. Следующим этапом является реакция связывания исследуемого белка со специфическим антителом (первичным).

Раствор антител и мембрана
могут быть вместе закрыты и
инкубированы от 30 минут
до оставления на ночь.
Также они могут быть
инкубированы при
различных температурах,
при повышенной
температуре наблюдается
лучшее связывание.
После удаления
несвязавшихся первичных
антител, мембрану
выдерживают со вторичными
антителами и в соответствии
с их целевыми свойствами,
как правило называются по

Антитела для вестерн блоттинга. Механизм детекции.

Антитела получают из
животного источника и
связываются с
большинством первичных
антител. Вторичные
антитела обычно связывают
щелочной фосфатазой или
пероксидазой хрена.
Наиболее
распространенные,
связанные с пероксидазой
хрена вторичные антитела
используются для
разрезания
хемилюминесцентного
агента, и продукт реакции
производит люминесцентное
излучение пропорционально
количеству белка.
Лист светочувствительной
фотографической пленки
помещается напротив мембраны
и подвергается действию
излучения реакции, создавая
изображение полос антител на
блоте.
Более дешевый, но менее
чувствительный подход с
использованием 4хлорнафтольного окрашивания
в смеси с 1 % перекисью
водорода, что дает темнокоричневое окрашивание,
которое регистрируется без
использования специальной
фотографической пленки.

Другой метод детекции
вторичными антителами
использует антитела со
связанным флюорофором,
который излучает в
ближней инфракрасной
области (NIR). Свет,
излучаемый
флюоресцентным
красителем, постоянен и
делает флюоресцентную
детекцию более точным и
чувствительным способом
измерения разницы в
сигнале, производимом
белками, которые мечены
антителами, на вестерн
блоте.

Детекция. Другие методы детекции.

Третий альтернативный
метод использует
радиоактивную метку
вместо фермента,
связанного с вторичным
антителом (с
радиоактивным изотопом
йода). Другие методы
безопаснее, быстрее и
дешевле, поэтому
радиоактивная детекция
используется редко.

Визуализация.

Визуализация
осуществляется с
помощью гельдокументирующих
систем или цифровой
камерой.

Представление фильма

Stain free technology

На практике, не во всех
вестернах обнаруживают
белки лишь по одному бэнду
на мембране.
Приблизительный размер
вычисляют сравнивая
окрашенные бэнды с
маркерами молекулярной
массы, добавленными при
электрофорезе.
Процесс повторят с
структурными белками,
такими как актин или
тубулин, которые не
меняют между
экспериментами. Количество
целевого белка зависит от
количества контрольного
структурного белка между
группами. Этот прием
обеспечивает коррекцию
количества общего белка на
мембране в случае ошибки

Анализ и представление результатов.

Использование
программного
приложения Image
J.
Программного
приложение BioRad

ИГХ
Иммунная
флюоресценция
Вестерн
блоттинг

Применение метода

Вестерн-блоттинг
используется
в молекулярной
биологии, биохимии, гене
тике и в других
естественно-научных
дисциплинах.
В медицине:
диагностика ВИЧ
(СПИД), болезнь
лайма,Helicobacter
Pylori, вирус ЭпштейнБарр

Полный протокол

1. электрофорез
2. перенос
3. блокирование
4. инкубация с
первичным антителом
5.отмывка
6.инкубация со
вторичным антителом
7. отмывка
8. обработка
хемилюминесцентной
системой детекции
9. детекция с помощью
рентгеновской пленки
10. анализ

Применение в практической медицине

Подтверждение
инфицированности ВИЧ
Диагностика клещевого
боррелиоза (болезнь Лайма)
Диагностика сибирской язвы
Диагностика токсоплазмоза
(Т);
группу инфекций –
гепатиты, сифилис,
хламидиоз, листериоз и др.
(О);
краснуху (R);
цитомегаловирусную
инфекцию (С);
герпес (Н).
Вирус Эпштейн-Барр
В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены
только
клинически
значимые
антигены
(нативные,
синтетические или рекомбинантные) в определенном
порядке. Такой подход используют для дифференциальной
диагностики нескольких инфекций на одном стрипе

Western blotting uses to identify proteins that have been separated based on size by gel electrophoresis. The immunoassay uses a membrane made of nitrocellulose or PVDF (polyvinylidene fluoride). The gel is placed next to the membrane and application of an electrical current induces the proteins to migrate from the gel to the membrane. The membrane can then be further processed with antibodies specific for the target of interest, and visualized using secondary antibodies and detection reagents.

View our Western blot protocol video below.

​Solutions and reagents: lysis buffers

These buffers may be stored at 4°C for several weeks or aliquoted and stored at -20°C for up to a year.

NP-40 buffer

• 150 mM NaCl
• 1.0% NP-40 (possible to substitute with 0.1% Triton X-100)
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• Protease inhibitors

RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer)

• 150 mM NaCl
• 1.0% NP-40 or 0.1% Triton X-100
• 0.5% sodium deoxycholate
• 0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• Protease inhibitors
  ​

Tris-HCl

• 20 mM Tris-HCl
• Protease inhibitors

​Solutions and reagents: running, transfer and blocking buffers

• 4% SDS
• 10% 2-mercaptoethanol
• 20% glycerol
• 0.004% bromophenol blue
• 0.125 M Tris-HCl

Check the pH and adjust to 6.8
​

Running buffer (Tris-Glycine/SDS)

• 25 mM Tris base
• 190 mM glycine
• 0.1% SDS

Transfer buffer (wet)

• 25 mM Tris base
• 190 mM glycine
• 20% methanol
• Check the pH and adjust to 8.3

For proteins larger than 80 kDa, we recommend that SDS is included at a final concentration of 0.1%.

Transfer buffer (semi-dry)

• 48 mM Tris
• 39 mM glycine
• 20% methanol
• 0.04% SDS

Blocking buffer

3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)

Add to TBST buffer. Mix well and filter. Failure to filter can lead to spotting, where tiny dark grains will contaminate the blot during color development.

​Sample lysis

​Preparation of lysate from cell culture

1. Place the cell culture dish on ice and wash the cells with ice-cold PBS.
2. Aspirate the PBS, then add ice-cold lysis buffer (1 mL per 10 7 cells/100 mm dish/150 cm 2 flask; 0.5 mL per 5x10 6 cells/60 mm dish/75 cm 2 flask).
3. Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper, then gently transfer the cell suspension into a pre-cooled microcentrifuge tube. Alternatively cells can be trypsinized and washed with PBS prior to resuspension in lysis buffer in a microcentrifuge tube.
4. Maintain constant agitation for 30 min at 4°C.
5. Centrifuge in a microcentrifuge at 4°C. You may have to vary the centrifugation force and time depending on the cell type; a guideline is 20 min at 12,000 rpm but this must be determined for your experiment (leukocytes need very light centrifugation).
6. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.

​Preparation of lysate from tissues

1. Dissect the tissue of interest with clean tools, on ice preferably, and as quickly as possible to prevent degradation by proteases.
2. Place the tissue in round-bottom microcentrifuge tubes or Eppendorf tubes and immerse in liquid nitrogen to snap freeze. Store samples at -80°C for later use or keep on ice for immediate homogenization. For a ~5 mg piece of tissue, add ~300 μL of ice cold lysis buffer rapidly to the tube, homogenize with an electric homogenizer, rinse the blade twice with another 2 x 200 μL lysis buffer, then maintain constant agitation for 2 h at 4°C (eg place on an orbital shaker in the fridge). Volumes of lysis buffer must be determined in relation to the amount of tissue present; protein extract should not be too dilute to avoid loss of protein and large volumes of samples to be loaded onto gels. The minimum concentration is 0.1 mg/mL, optimal concentration is 1–5 mg/mL.
3. Centrifuge for 20 min at 12,000 rpm at 4°C in a microcentrifuge. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice; discard the pellet.

Sample preparation

1. Remove a small volume of lysate to perform a protein quantification assay. Determine the protein concentration for each cell lysate.
2. Determine how much protein to load and add an equal volume 2X Laemmli sample buffer.​

   We recommend reducing and denaturing the samples using the following method unless the online antibody datasheet indicates that non-reducing and non-denaturing conditions should be used.

3. To reduce and denature your samples, boil each cell lysate in sample buffer at 100°C for 5 min. Lysates can be aliquoted and stored at -20°C for future use.

1. Load equal amounts of protein into the wells of the SDS-PAGE gel, along with molecular weight marker. Load 20–30 μg of total protein from cell lysate or tissue homogenate, or 10–100 ng of purified protein.
2. Run the gel for 1–2 h at 100 V.

The time and voltage may require optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. A reducing gel should be used unless non-reducing conditions are recommended on the antibody datasheet.

The gel percentage required is dependent on the size of your protein of interest:

Protein size	Gel percentage

Gradient gels can also be used.

​Transferring the protein from the gel to the membrane

The membrane can be either nitrocellulose or PVDF. Activate PVDF with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer before preparing the stack. The time and voltage of transfer may require some optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. Transfer of proteins to the membrane can be checked using Ponceau S staining before the blocking step.

Prepare the stack as follows:

Figure 1. Example of prepared stack.

Antibody staining

1. Block the membrane for 1 h at room temperature or overnight at 4°C using blocking buffer.
2. Incubate the membrane with appropriate dilutions of primary antibody in blocking buffer. We recommend overnight incubation at 4°C; other conditions can be optimized.
3. Incubate the membrane with the recommended dilution of conjugated secondary antibody in blocking buffer at room temperature for 1 h.
4. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
5. For signal development, follow the kit manufacturer’s recommendations. Remove excess reagent and cover the membrane in transparent plastic wrap.
6. Acquire image using darkroom development techniques for chemiluminescence, or normal image scanning methods for colorimetric detection.

Useful links

All lanes: beta Actin antibody - loading control (ab8227) at 1/5000 dilution

Lane 1: HeLa whole cell extract
Lane 2: Yeast cell extract
Lane 3: Mouse brain tissue lysate

• View our list of available positive control lysates , blocking peptides and positive control proteins.
• View for exceptional western blots.

Protocols are provided by Abcam “AS-IS” based on experimentation in Abcam’s labs using Abcam’s reagents and products; your results from using protocols outside of these conditions may vary.

Webinar transcript​

The purpose of western blotting is to separate proteins on a gel according to the molecular weight. The proteins are then transferred onto a membrane where they can be detected using antibodies. Heat the samples and 95 degrees C for five to 10 minutes in a sample buffer containing a reducing agent such as beta mercaptoethanol. This results in linearized proteins with a negative charge proportional to their size.

Place a gel into the electrophoresis tank and ad in buffer, ensuring the tops of the wells are covered. Acrylamide percentage of the gel being used depends on the molecular weight of the target protein. Node a molecular weight market into the first lane then load the samples into adjacent wells. All the samples which contained equal amounts of protein. Once all the samples are loaded, ad running buffer, place the lid onto the electrophoresis tank. Turn on the power supply and set the voltage recommended by the manufacturer of the gels in the gel tank. You should be able to see bubbles rising through the tank. Run the gel until the die front has moved sufficiently down the gel.

The next stage is to transfer the proteins from the gel onto a membrane. Membranes are usually made from nitrocellulose or PVDF. Remove the gel from the tank and carefully release it from its plastic case. Cut up the wells and the gel foot and place the gel into transfer buffer. Prepare the transfer stack by sandwiching the membrane and gel between filter paper and sponges. The membrane should be traced to the positive electrode and the gel closest to the negative electrode. Use a small roller to remove any bubbles between the gel and the membrane. Cap the transfer case closed and submerge into a transfer tank containing transfer buffer. Add water to the outer chamber to keep the system cool and put on the lid. Turn on the power supply to begin protein transfer. Time and voltage require optimization, so check the manufacturer"s instructions for guidance.

Now that the proteins have migrated from the gel onto the nitro cellulose membrane, the protein of interest can be detected as an antibody. The membrane can be removed from the cassette and the molecular weight market should now be visible. If required, the transfer of proteins can be confirmed by staining the membrane with solution. To prevent nonspecific binding of the antibody, the membrane needs to be blocked. Pour blocking buffer onto the membrane and agitate gently on a rocker. Typically, this is done using a solution of five percent milk or bovine serum albumin, BSA, for two hours at room temperature or overnight at four degrees. The time and type of blocking buffer should be optimized, so check the data sheet of the primary antibody you intend to use for details.

After the membrane is blocked, remove the blocking buffer and add the diluted primary antibody in the same solution. Incubate on the rocker as before. Typically primary antibody incubations are for one hour at room temperature or overnight at four degrees C. Antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Refer to the antibody datasheet for guidance. Pour off the primary antibody and rinse the membrane twice in wash buffer. Follow with one 15 minute wash and three 10 minute washes on a rocker. The wash buffer is usually Trys buffered saline, TBS, or phosphate buffered, saline, PBS, with 0.1 percent tween 20.

Pour off the wash buffer and incubate the membrane in conjugating secondary antibody which has been diluted in blocking buffer. Usually this is done for one hour at room temperature, but antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Pull off the secondary antibody and wash the membrane has shown previously.

There are several different systems for detection. If the secondary antibodies conjugate into an enzyme, incubate the membrane in the appropriate substrate before imaging. If the secondary antibodies are fluorescent counjugates then you can move directly onto the imaging step. Imaging can be carried out with x Ray film or with a digital imaging system. Place the membrane into an imaging tray. Place the imaging tray into imaging system. Exposure times will most likely need to be optimized in order to clearly detect the bands relating to the proteins of interest.

Общие.

Все способы постановки Western состоят из следующих этапов:

1) перенос белка из геля на мембрану;
2) забивка неспецифической сорбции;
3) адсорбция I-антител;
4) отмывка;
5) адсорбция II -антител;
6) отмывка;
7) проявление фильтра;

Какой тип мембраны использовать: NC или PVDV (говорят, последняя чувствительнее) зависит только от вашего вкуса. NC мембрана более хрупкая, но при аккуратной работе это незаметно.

По пунктам.

Обрезать ли гель, оставив лишь область, которую вы хотите увидеть на картинке до переноса, после переноса или вообще не обрезать, зависит от вашего желания экономить мембрану и антитела.

Можно в ванночке с гелем.

Но лучше всё накладывать сразу без пузырей.

Или ~3mA на индивидуальную полоску.

Иногда полезно отметить положение границ геля, лунок и т.п.

Можно проконтролировать как много белка осталось в геле после переноса покрасив гель.

Гибридизация.

Фильтр всегда должен быть влажным.

Высохшую PVDF мембрану нужно смачивать метанолом.

Соприкасаться с раствором должна сторонаP(на которую шел перенос).

Гибридизация с а/т проводится в гибридайзере при 26 o C в маленьких цилиндрах или 50ml ЦФ-пробирках. Объём гибридизационного раствора ~3ml (по возможности минимальный, но чтобы мембрана не подсыхала).

Отмывка и забивка: при NT покачивая в ванночке (крышке от типов) V=30-50ml.

Раствор либо выбросить, либо в нем же проводить гибридизацию, только не надо капать на фильтр концентрированные а/т.

Для забивки неспецифики лучше всего использовать сухое молоко, (можно и BSA, но он нам нравится меньше). Разные партии несколько отличаются между собой по интенсивности фона.

Налить гибридизационный раствор в 50ml ЦФ-пробирку, добавить нужное количество а/т, смешать. Проложить фильтр по стенке пробирки, поставить в гибридайзер.

Если вы не знаете в каком разведении работают а/т, то вам придётся определить это экспериментально.

Время взаимодействия с антителами можно увеличивать или уменьшать в зависимости от ваших антител.

Гибридизация проводится в 0.1-0.15М NaCl, снижение ионной силы вызывает сильную неспецифическую гибридизацию.

Очень важно!!! Раствором с антителами можно пользоваться несколько раз (5-7). Достаточно заморозить его после использования на -20 o С. Эта процедура работает по крайней мере для гибридизационного буфера: 1x PBS (without Mg++/Ca++) , 0.3-1.0% Dry milk, Antibodies.

При иммуноокрашивании после иммунопреципитации фон можно убрать преконъюгировав предварительно вторичные антитела с первичными.

Приведённая процедура - не единственная. Варианты:

1. Все делать при NT на качающейся платформе, гибридизация и забивка в целлофановых пакетах (V раствора ~1.5мl, в зависимости от размера фильтра), отмывка в ванночке:
1. забивка: 3% сухое молоко, 1х PBS, 30-40";
2. "I"а/т: 1h 0.3% сухое молоко, 1х PBS, антисыворотка;
3. отмывка 3 раза х 5": 1х PBS, 0.05% Tween-20;
4. "II"а/т: 30" в 1х PBS;
5. отмывка как в п.3.

Несмотря на существенно более низкое содержание сухого молока в гибридизационном буфере для "I"а/т и полное его отсутствие в буфере для "II"а/т этот метод давал чистые картинки. Видимо, успех определялся качеством использованных а/т.

2. Отмывка и забивка проводятся в ванночке. Гибридизация: на стол положить кусок парафильма (больше мембраны), на него - 0.5-1ml гибридизационного раствора с а/т. Положить мембрану стороной (Р) к раствору, избегая пузырей, сверху прикрыть куском парафильма размером с мембрану. Инкубировать 1h.

Этот способ сокращает объём гибридизационной смеси, но может ухудшить качество гибридизации.

Максимум свечения наступает через 4-5" после нанесения раствора (разумная интенсивность свечения сохраняется в течение 15-20").

Содержимое (Table of Contents)

ОФС.1.7.2.0022.15 Определение подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных препаратов методом вестерн-блот

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод вестерн-блот, один из вариантов иммуноблоттинга, который используют для оценки подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) на основе высокоочищенных белков, в том числе, полученных по технологии рекомбинантной ДНК.

На первом этапе проводят электрофорез в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом (так называемый, SDS-PAGE электрофорез) для разделения белков. Затем белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану или PVDF-мембрану (мембрана из поливинилденфторида). Детекцию проводят с помощью специфичных к определяемому белку антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена (прямой вариант ИФА), или последовательно с помощью первых антител к определяемому белку, и вторых антител (так называемой, антиглобулиновой сыворотки), специфичных к иммуноглобулину первых антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена (непрямой вариант ИФА).

В данной ОФС изложен метод детекции на основе цветной реакции, как один из наиболее широко применяемых в настоящее время. Для детекции также могут быть использованы хемилюминесцентный метод, в том числе, с усилением хемилюминесценции, и методы радиоактивной или флуоресцентной меток (РИА или РИФ).

Испытание проводят с фармацевтическими субстанциями или с готовой продукцией.

При оценке подлинности, на этапе выполнения электрофореза, помимо испытываемых образцов, должно быть предусмотрено внесение в лунки геля следующих растворов: отрицательный контрольный образец (1-кратный буфер для приготовления образцов), смесь маркеров молекулярных масс (рекомендуется использование предварительно окрашенных маркеров молекулярных масс), стандартный образец испытываемого белка (при его наличии), аттестованный в установленном порядке. При оценке чистоты (примесей) дополнительно должно быть предусмотрено внесение образца с концентрацией белка, соответствующей пределу обнаружения или количественного определения примеси (в зависимости от назначения методики) и установленной на основании результатов валидации методики. При оценке чистоты необходимо сравнение результатов блота с результатами электрофореза в полиакриламидном геле; методика должна выявлять 1 % примеси.

Методика

Для разделения белков по их молекулярным массам предварительно проводят электрофорез в соответствии с методикой, изложенной в и ОФС «Электрофорез в полиакриламидных гелях».

Для проведения переноса белков используют прибор для переноса белков. Все работы проводят в резиновых перчатках. Объем всех используемых растворов должен быть достаточен для полного погружения мембраны, на которую переносят белки.

После проведения электрофореза для подготовки геля к иммуноблотингу, его заливают буферным раствором для переноса белков (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации), ставят на орбитальный шейкер и выдерживают в течение 10-15 мин. Затем подготавливают лист нитроцеллюлозной или PVDF-мембраны, соответствующий размеру геля. При использовании нитроцеллюлозной мембраны лист выдерживают 5 мин в деионизованной воде, а затем 5 мин в буферном растворе для переноса белков (если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации). При использовании PVDF-мембраны ее необходимо выдержать в растворе метанола или спирта в течение 10-15 мин, а затем произвести аналогичные действия, что и для нитроцеллюлозной мембраны.

Для переноса белков на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану собирают «сэндвич». Для этого специальную губку, входящую в комплект прибора для переноса белков, смачивают в буферном растворе для переноса белков и помещают на специальную пластиковую рамку, на которую затем помещают от одного до трех листов фильтровальной бумаги (например, Whatman 3MM), предварительно обрезанных в соответствии с размером мембраны и смоченных в растворе для переноса белков. Сверху помещают гель, на поверхность которого аккуратно (без пузырьков воздуха) помещают приготовленный лист нитроцеллюлозной или PVDF-мембраны. На мембрану помещают от одного до трех листов фильтровальной бумаги, предварительно смоченных в растворе для переноса белков, и сверху прикрывают второй специальной губкой, смоченной в растворе для переноса белков. Рамку скрепляют зажимами и медленно погружают в прибор для электрофореза, заполненный раствором для переноса белков, лист мембраны должен быть обращен к аноду. Включают прибор. Электрофоретический перенос белков осуществляют при комнатной температуре в течение 25 мин, выставив ограничение по току из расчета A max = 2 мА/см 2 , (например, для геля размером 10×10см 2 A max = 200 мА), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации.

Допускается использование оборудования для полусухого переноса белков с геля на мембрану в соответствии с инструкцией по его применению.

По окончании переноса «сэндвич» разбирают. Мембрану промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ).

Оценивают полноту переноса белков визуально по переносу окрашенных маркеров молекулярных масс, все основные белковые полосы которого должны быть выявлены на мембране.

Детекция

Для детекции результатов метода вестерн-блот проводят обработку (гибридизацию) исследуемого препарата антителами. Для этого мембрану с перенесенными на нее белками помещают в контейнер с блокирующим буферным раствором и инкубируют на орбитальном шейкере в течение 30 – 60 мин (если не предусмотрено иное в фармакопейной статье или нормативной документации) для предотвращения неспецифической сорбции антител на мембране.

После этого промывают мембрану в буферном растворе для отмывки трижды по 5 мин, если не указано иное в фармакопейной статье или нормативной документации.

Затем мембрану обрабатывают раствором первых антител к анализируемому белку, приготовленным с использованием буферного раствора для антител (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации) непосредственно перед использованием в соответствии с инструкцией по применению. Обработку антителами проводят при комнатной температуре в течение 30 – 60 мин (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации).

Далее трижды по 5 мин проводят отмывку мембраны буферным раствором от несвязавшихся антител на орбитальном шейкере при комнатной температуре, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации.

После отмывки мембраны, проводят обработку (гибридизацию) раствором вторых антител. В качестве вторых антител используют поликлональные антитела к иммуноглобулинам того вида животного, которое использовалось для получения первых антител. Данные антитела конъюгированы с ферментом (пероксидаза из корней хрена или щелочная фосфатаза). Для выполнения этого этапа повторяют процедуру, описанную выше, заменив раствор первых антител раствором вторых антител. Затем проводят аналогичную первой отмывку мембраны от несвязавшихся вторых антител.

Проявление картины иммуноблота на мембране проводят раствором тетраметилбензидинового субстрата (ТМВ) для антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, или раствором для проявления щелочной фосфатазы – при использовании антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой (если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации).

Реакцию останавливают, промывая блот деионизованной водой. С поверхности мембраны удаляют излишек воды фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе в темном месте.

Оценка результатов

При оценке подлинности основные окрашенные полосы на проявленной мембране должны соответствовать основным окрашенным полосам на электрофореграмме.

Количество анализируемого вещества и содержание примесей, а также их соотношение оценивают денситометрически.

Критерии пригодности системы

Результаты метода вестер-блот могут учитываться, если:

• маркеры молекулярных масс распределены равномерно по всей длине соответствующей дорожки геля;
• на блоте видны все основные полосы, выявленные при окрашивании геля Кумасси ярко-голубым R-250 или G-250;
• выявляется образец с минимальной концентрацией, установленной в фармакопейной статье или нормативной документации

Критерии приемлемости результатов

• Совпадение блота исследуемого образца с блотом образца сравнения, например, соответствующего стандартного образца на основе очищенного белка (субстанции);
• соответствие молекулярной массы основного выявленного компонента требованиям спецификации;
• соответствие содержания выявляемой примеси в стандартном образце диапазону, установленному в свидетельстве на стандартный образец.

Методику определения подлинности и чистоты методом вестерн – блот следует использовать с подтвержденными валидационными характеристиками в отношении специфичности и предела обнаружения примеси.

Особенности валидация методики

При использовании методики для оценки подлинности необходимо обосновать критерии приемлемости результатов; целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка, аттестованного в установленном порядке.

При использовании методики для оценки чистоты необходимо обосновывать предел обнаружения примеси. При количественном определении необходимо обосновать предел количественного определения примеси, указать линейный диапазон при определении основного компонента и примесей, прецизионность и правильность методики. Для этого целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка. При внесении изменений в методику, указанную в фармакопейной статье или нормативной документации, должны быть подтверждены валидационные характеристики ранее утвержденной методики. Валидации подлежат следующие изменения:

• использование различного количества наносимых на гель проб;
• изменение условий переноса белков с геля на мембрану, включая изменение используемого оборудования;
• изменения состава буферных растворов;
• изменение способа детекции исследуемого вещества.

Примечания.

1. Буферный раствор для переноса белков рН 8,3. Если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, используют один из описанных ниже способов приготовления растворов (см. Вариант 1 и Вариант 2). Раствор для переноса можно использовать 2-3 раза. Раствор хранят в течение 6 мес при температуре от 4 до 8 0 С.

Вариант 1. В градуированный химический стакан вместимостью 3000 мл помещают 7,86 г трис(гидроксиметил)аминометана, 33,75 г глицина, добавляют до 2400,0 мл деионизованной воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Измеряют рН, который должен быть равен 8,3 – 8,4 (доводить рН раствора кислотой или щелочью не допускается). Добавляют 600,0 мл спирта и перемешивают.

Вариант 2. В градуированный химический стакан вместимостью 1000 мл помещают 5,8 г трис(гидроксиметил)аминометана, 2,9 г глицина, 11,55 мл 10 % раствора натрия додецилсульфата, добавляют 800,0 мл деионизованной воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения, измеряют pH (8,3-8,4). Добавляют 200,0 мл 100 % метанола и перемешивают. Если используется PVDF-мембрана, то натрия додецилсульфат из буферного раствора исключают, а количество спирта уменьшают до 100,0 мл, увеличивая тем самым объем добавляемой воды до 900,0 мл.

1. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), рН 7,2 (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации). В градуированную емкость наливают 4500,0 мл деионизованной воды и последовательно прибавляют: 40,0 г натрия хлорида, 1,0 г калия хлорида 5,75 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 2х-водного, 1,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного (каждую следующую соль прибавляют после полного растворения предыдущей). Устанавливают рН до 7,2 раствором 70 % ортофосфорной кислоты или раствором 45% натрия гидроксида. Доводят объем до 5000,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в течение 3 мес при температуре 4 — 8 0 С.
2. Буферный раствор для отмывки . В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 5,0 мл 10 % раствора твин-20, доводят объем раствора до метки с помощью ФСБ и перемешивают. Раствор хранят в течение 1 мес при температуре от 4 °С до 8 °С.
3. Блокирующий буферный раствор. К 100,0 мл буферного раствора для отмывки прибавляют 5,0 мг бычьего сывороточного альбумина (или другого белка), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и перемешивают до полного растворения. Раствор готовят перед использованием.
4. Буферный раствор для антител. К 100,0 мл буферного раствора для отмывки прибавляют 2,0 мг бычьего сывороточного альбумина (или других белков), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и перемешивают до полного растворения. Раствор готовят перед использованием.

1. Раствор ТМВ — раствор для проявления пероксидазы хрена. Используют TMB-субстрат, готовый к применению.
2. Раствор для проявления щелочной фосфатазы. Растворяют 1 таблетку субстрата BCIP/NBT в 10,0 мл деионизованной воды. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Предыдущая статья: Что нельзя делать в Великий пост? Следующая статья: Приемы нлп в любви примеры фраз